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Scientific Reports 13권, 기사 번호: 10093(2023) 이 기사 인용

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호중구 세포외 트랩(NET)을 다른 형태의 세포 사멸과 구별하는 정의 생물학은 해결되지 않았으며 NET를 명확하게 식별하는 기술은 여전히 ​​파악하기 어렵습니다. 라만 산란 측정은 지질 및 단백질과 같은 구성 요소의 특징적인 결합 진동을 기반으로 세포 분자 구성에 대한 전체적인 개요를 제공합니다. 우리는 단일 세포의 스펙트럼을 신속하게 측정할 수 있는 맞춤형 고처리량 플랫폼을 사용하여 NET에서 라만 스펙트럼을 수집하고 괴사 세포를 동결/해동했습니다. NET의 라만 스펙트럼의 주성분 분석은 유사한 형태에도 불구하고 괴사 세포와 명확하게 구별되어 근본적인 분자 차이를 보여줍니다. 대조적으로, NET 분석, 면역형광 현미경, 세포외 DNA 및 ELISA에 사용되는 고전적인 기술은 이들 세포를 구별할 수 없습니다. 또한 라만 스펙트럼의 기계 학습 분석은 PMA(포르볼 미리스테이트 아세테이트) 유도 NET와는 대조적으로 LPS(지질다당류) 유도의 미묘한 차이를 나타냈으며, 이는 NET의 분자 구성이 사용된 자극제에 따라 다르다는 것을 보여줍니다. 이 연구는 NET를 다른 유형의 세포 사멸 및 유도 경로와 구별하는 데 있어 라만 현미경의 이점을 보여줍니다.

호중구 세포외 트랩(NET)은 핵이 파괴되고 구름이나 끈 같은 구조에서 DNA가 방출되는 것을 특징으로 하는 세포 사멸의 한 형태입니다1,2. 섬세하고 다양한 특성으로 인해 NET의 특성화를 위한 구체적이고 간단한 기술의 개발이 어려웠습니다3,4. 많은 연구에서 NET 형성이 세포 사멸의 제어되고 뚜렷한 형태라는 것이 입증되었지만2,5 다른 세포 사멸 경로와 상당한 중복이 존재하며 NET의 정확한 정의는 논쟁 중입니다4. DNA 탈축합 및 방출은 NET를 세포사멸, 괴사 및 파이롭토시스와 같은 프로세스와 구별하며, 모두 핵 응축을 초래합니다6,7. 그러나 많은 세포 사멸 경로의 후기 단계에서는 핵이 파괴되고 DNA가 방출되어 잠재적으로 종말점 분석이 혼란스러울 수 있습니다. 예를 들어, 세포사멸 이후에 발생하는 2차 괴사는 DNA 탈수, 세포 용해 및 세포외 내용물 방출을 초래합니다8,9,10. 또한, 세포의 생리학적 손상에 의해 직접적으로 발생하는 괴사와 같은 규제되지 않은 세포 사멸은 NET 형성과 현저하게 유사한 특징을 초래할 수 있습니다. 세포 사멸을 유발하기 위해 활성화되는 경로, 잠재적인 병리학적 결과를 완화하기 위해 경로를 제어할 수 있는 방법, 세포 사멸이 생리학적 손상 또는 세포에 대한 스트레스의 결과인지를 이해하려면 이러한 유형의 세포 사멸을 구별하는 것이 중요합니다. 실험 절차이거나 진정한 프로그램된 세포 사멸 경로6입니다.

NET 검출 및 정량화는 일반적으로 세포외 DNA 측정, 세포 형태 및 단백질 마커의 조합에 의존하며, 가장 일반적인 것은 골수과산화효소(MPO), 호중구 엘라스타제(NE) 및 시트룰린화 히스톤입니다. 세포외 DNA 측정은 PicoGreen2와 같은 형광 염료를 사용하여 상층액으로 방출된 DNA를 측정합니다. Sytox Green과 같은 불침투성 DNA 염료는 NET를 염색하는 데 자주 사용되는 반면 손상되지 않은 막이 있는 세포를 제외하여 유세포 분석과 같은 기술로 정량화할 수 있습니다. 구현하기 쉽지만 이러한 기술은 NET를 다른 형태의 세포 사멸과 구별할 수 없기 때문에 제한됩니다. 형태학 분석은 이를 개선하지만 이미징과 수동 계산 또는 자동 이미지 처리가 필요합니다. 이는 힘들고 편향을 유발할 수 있으므로 정확성을 향상시키기 위한 노력의 일환으로 단백질 마커가 도입되는 경우가 많습니다. 이미징 기술을 지원할 뿐만 아니라 단백질 마커는 샌드위치 ELISA에 활용되며, 여기서 NET는 일반적으로 항MPO인 단백질 항체를 사용하여 고정되고 DNA에 대한 항체를 통해 검출됩니다(또는 그 반대)21,22,23.