Clostridium acetottyicum에서 부탄올 합성을 위한 누락된 전자 경로의 분자적 특성 규명

Nature Communications 13권, 기사 번호: 4691(2022) 이 기사 인용

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Clostridium acetottyicum은 n-부탄올의 재생 가능한 생산을 위한 유망한 생체촉매입니다. 부탄올 수율을 높이기 위해 여러 가지 대사 전략이 이미 개발되었으며, 대부분 탄소 경로 방향 전환을 기반으로 합니다. 그러나 이전에는 코딩 유전자가 알려지지 않은 페레독신-NADP+ 환원효소와 페레독신-NAD+ 환원효소의 활성이 용매 생성 조건에서 부탄올 합성에 필요한 NADPH와 추가 NADH를 생산하는 데 필요하다는 것이 입증되었습니다. 여기에서 우리는 두 가지 활동을 모두 담당하는 단백질을 정제, 식별 및 부분적으로 특성화하고 역유전적 접근법을 통해 부탄올 합성에 식별된 효소의 관여를 입증합니다. 우리는 부탄올 형성의 수율이 CA_C0764, 페레독신-NADP+ 환원효소 코딩 유전자 및 페레독신-NAD+ 환원효소를 코딩하는 bcd 오페론의 발현 수준에 의해 제한된다는 것을 추가로 입증합니다. 이러한 효소를 대사 공학 전략에 통합하면 호모부탄올 생성 C. 아세토부틸리쿰 균주를 개발할 수 있는 기회가 제공됩니다.

Clostridium acetottyicum은 다양한 당과 다당류를 유기산(아세테이트 및 부티레이트)과 용매(아세톤, 부탄올 및 에탄올)로 전환할 수 있는 그람 양성 포자 형성 혐기성 박테리아입니다. 벌크 화학 물질인 아세톤과 부탄올1,2,3의 산업적 생산에서의 중요성과 에탄올4,5에 비해 몇 가지 장점을 지닌 유망한 바이오 기반 액체 연료인 n-부탄올 생산에서의 잠재적인 사용으로 인해 많은 연구가 집중되었습니다( i) 용매 형성의 조절6,7,8,9,10,11,12,13,14,15을 이해하고 (ii) 이 미생물을 대사적으로 조작하여 높은 수율의 알코올을 생산합니다.

C. acetottyicum의 인산염 제한 케모스타트 배양물의 용매 생성 대사 특성화에 대한 글로벌 시스템 생물학 접근 방식을 사용하여 아세틸-CoA를 부탄올로 전환하는 것과 관련된 6단계(그림 1)가 이전에 특성화되었습니다. 크로토닐-CoA를 부티릴-CoA로 환원시키는 역할을 하는 것은 2몰의 NADH를 소비하고 1몰의 환원된 페레독신을 생성하는 분기 효소인 BCD 복합체(bcd, etfB 및 etfA, bcd 오페론으로 인코딩됨)인 것으로 나타났습니다. 부탄올 생산의 마지막 두 단계는 NADH 의존성 알데히드 탈수소효소 활성을 통해 AdhE1에 의해, 그리고 NADPH 의존성 부탄올 탈수소효소 활성을 통해 BdhB, BdhC 및 BdhA에 의해 촉매되는 것으로 나타났습니다. 이러한 결과는 아세틸-CoA로부터 부탄올 합성에 필요한 NADPH와 추가 NADH를 생성하는 데 페레독신-NADP+ 환원효소와 페레독신-NAD+ 환원효소 활성이 모두 필요하다는 것이 입증되었기 때문에 전자 흐름 분포에 큰 영향을 미쳤습니다(그림 2). 19. 이러한 효소의 활성은 이전에 C. acetottyicum에서 검출되었지만 인코딩 유전자는 아직 알려지지 않았습니다. Ferredoxin-NADP+ 환원효소 효소(FNOR)(EC 1.18.1.3)는 원핵생물에서 진핵생물, 특히 식물에 이르기까지 다양한 호기성 유기체에 분포되어 있지만22 어떤 클로스트리디움 종에서도 정제 및 특성화한 적이 없습니다. 대조적으로, 양성자 방출(Rnf) 및 페레독신 의존성 트랜스하이드로게나제(Nfn)와 결합된 페레독신 의존성 NAD+ 감소는 여러 클로스트리듐 종에서 분자 관점에서 특성화되었지만 C. acetottyicum23,24,25에서는 상동체가 발견되지 않았습니다. 더욱이, C. acetottyicum은 산화성 오탄당-인산 경로에 의해 NADPH를 생산할 수 없는 것으로 나타났습니다. 이는 이 경로의 첫 번째이자 핵심 효소인 포도당-6-P 탈수소효소를 암호화하는 유전자가 없기 때문입니다19,26.

녹색 상자는 산성 조건 하의 1차 생성물을 나타내고, 빨간색 상자는 용매 생성 조건 하의 1차 생성물을 나타냅니다. 빨간색과 이탤릭체로 표시된 문자는 해당 유전자를 나타냅니다. ack 아세테이트 키나제, adc 아세토아세테이트 탈탄산효소, adhE1 알데히드 탈수소효소, adhE2 이관능성 알데히드/알코올 탈수소효소, alsD 알파-아세토락테이트 탈탄산효소, alsS 아세토락테이트 합성효소, bcd 부티릴-CoA 탈수소효소, bdh 부탄올 탈수소효소, 북부티레이트 키나제, crt 크로토나제, ctfAB CoA-전이효소 , etf 전자 전달 플라보단백질, hbd 3-하이드록시부티릴-CoA 탈수소효소, 하이드로게나제, f또는 페레독신-NAD(P)+ 산화환원효소, pdc 피루베이트 탈탄산효소, p피루베이트:페레독신 산화환원효소, pta 포스포트랜스아세틸라제, ptb 포스포트랜스부티릴라제, thl 티올라제, gapC NADH 의존성 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소, gapN 비인산화 NADPH 생성 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소, Fd ox는 산화된 페레독신을 나타내는 반면, Fd red는 환원된 페레독신을 나타냅니다.